Autor: Jedináková, P.; Barbuscáková, Z; Milicevic, D.; Kubala, M.; Hlavác, J.
Název práce v češtině: Nová víceúčelová fluorescenční sonda FRET pro simultánní detekci proteáz
Název práce v angličtině: A new multi-purpose FRET fluorescent probe for the simultaneous detection of proteases
Studentská publikace: ne
Klíčová slova v češtině: fluorescence, proteázy, sonda, detekce
Klíčová slova v angličtině: fluorescence, proteases, probe, detection
Abstrakt česky: Byla vyvinuta a studována nová metodologie pro detekci tří modelových proteáz s využitím víceúčelové peptidové sondy
vybavené třemi selektivně štěpitelnými místy a čtyřmi fluorofory. Sonda
byla navržena jako systém s jednou excitací a trojitou emisí, který umožňuje monitorování
charakteristických změn fluorescenční emise jednotlivých fluoroforů v reálném čase
během enzymatického štěpení. Byla značena diethylaminokumarinem (DEAC), fluoresceinem (FL) a
rhodaminem B (RhB), čímž vznikla kaskáda DEAC / FL / RhB FRET, s odhadovanými Försterovými vzdálenostmi
3,08 ± 0,02 nm nebo 3,02 ± 0,02 nm pro pár DEAC / FL FRET (v závislosti na místě značení DEAC)
a 6,04 ± 0,05 nm pro pár FL / RhB FRET.. Ačkoli spektroskopické analýzy naznačují, že
se v sondě podílejí i jiné fotofyzikální procesy než FRET, obrovské změny v jejích intenzitách fluorescence
(např. intenzita fluorescence sondy pro excitační/emisní vlnové délky 421 nm/
476 nm je 50krát nižší ve srovnání s konstruktem značeným pouze DEAC nebo 200krát nižší
pro 480 nm/521 nm ve srovnání s konstruktem značeným pouze FL) umožňují snadnou detekci
proteázových aktivit. V režimu s jedním enzymem lze trypsin, chymotrypsin a trombin stanovit
podle poměrového grafického modelu při nejnižších detekovatelných koncentracích 0,0625 ng
ml−1, , 0,125 mg, ml−1 a 0,0125 U mL−1, . Připravená sonda v kombinaci se selektivními inhibitory (Kunitz, inhibitor trypsinu; chymostatin, inhibitor chymotrypsinu; a dabigatran, inhibitor trombinu) byla také úspěšně použita pro simultánní detekci jednotlivých proteáz v jejich dvou enzymových směsích. Nakonec byla sonda studována jako nástroj pro screening tří proteáz s použitím dvou vybraných inhibitorů. Bohužel nebyl nalezen univerzální model schopný jednoznačného potvrzení tří studovaných enzymů v různých kombinacích jejich množství.
Abstrakt anglicky: A new methodology for the detection of three model proteases using a multi-purpose peptide probe
equipped with three selectively cleavable sites and four fluorophores was developed and studied. The
probe was designed as a single-excitation, triple-emission system, allowing for the monitoring of
characteristic real-time changes in the fluorescence emission responses of individual fluorophores
during enzymatic cleavage. It was labelled with diethylaminocoumarin (DEAC), fluorescein (FL) and
Rhodamine B (RhB), forming the DEAC / FL / RhB FRET-cascade, with estimated Förster distances of
3.08 ± 0.02 nm or 3.02 ± 0.02 nm for the DEAC / FL FRET-pair (depending on the DEAC labeling site)
and 6.04 ± 0.05 nm for the FL / RhB FRET-pair. Although spectroscopic analyses indicate that
photophysical processes other than FRET are involved in the probe, the huge changes in its fluorescence
intensities (e.g., the fluorescence intensity of the probe for the excitation/emission wavelengths 421 nm/
476 nm is 50-fold lower compared to that of the DEAC-only labeled construct, or it is 200-fold lower
for 480 nm/521 nm compared to that of the FL-only labeled construct) enable the easy detection of
protease activities. In a single-enzyme mode, trypsin, chymotrypsin, and thrombin can be determined
according to the ratiometric graphical model at the lowest detectable concentrations of 0.0625 ng
mL−1
, 0.125 mg mL−1 , and 0.0125 U mL−1
, respectively. The prepared probe, in combination with
selective inhibitors (Kunitz, trypsin inhibitor; chymostatin, chymotrypsin inhibitor; and dabigatran,
thrombin inhibitor), was also successfully used for the simultaneous detection of individual proteases in
their two-enzyme mixtures. Finally, the probe was studied as a tool for three-protease screening using
two selected inhibitors. Unfortunately, a universal model capable of unambiguous confirmation of the
three studied enzymes in various combinations of their quantities has not been found.
Jazyk v originále: angličtina
Název časopisu: RSC Advances
Rok: 2025
Svazek (ročník): 15
Číslo časopisu v rámci uvedeného svazku: –
Strana od-do: 34821–34832
Impact factor: 4.6
Q1: ne

ISSN časopisu: 2046-2069
Vydavatel: Royal Society of Chemistry
Způsob financování: UP
DOI: DOI: 10.1039/d5ra03163j