Autor: Strnad, J.; Soural, M.; Šebela, M.
Název práce v češtině: Nová metoda stanovení aktivity pro diaminoxidázu založená na hmotnostní spektrometrii doby letu za pomoci matrice s laserovou desorpcí/ionizací
Název práce v angličtině: A New Activity Assay Method for Diamine Oxidase Based on Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry
Studentská publikace: ne
Klíčová slova v češtině: test aktivity; aminooxidáza; kinetika enzymů; MALDI; polyamin; rychlost reakce
Klíčová slova v angličtině: activity assay; amine oxidase; enzyme kinetics; MALDI; polyamine; reaction rate
Abstrakt česky: Diaminoxidázy obsahující měď jsou všudypřítomné enzymy, které se účastní mnoha důležité biologické procesy. Tyto procesy zahrnují regulaci růstu a dělení buněk, programovaná buněčná smrt a reakce na environmentální stresory. Mezi přírodní substráty patří například například putrescin, spermidin a histamin. Enzymatická aktivita se obvykle testuje pomocí spektrofotometrické, elektrochemické nebo fluorometrické metody. Cílem této studie bylo vyvinout Metoda měření aktivity pomocí matricově asistované laserové desorpce/ionizace time-of-flight (MALDI-TOF) hmotnostní spektrometrie založená na poměru intenzity produkt k produktu a substrátu signály v reakčních směsích. Za tímto účelem byl enzym vyčištěný do homogenity z hrachu Byl použit sazenice (Pisum sativum). Použitá metoda α-kyano-4-hydroxyskořicové kyseliny jako matrice s přídavkem cetrimonium bromidu. Intenzita signálu produktu s čistými sloučeninami byly vyhodnoceny v přítomnosti stejného množství substrátu pro stanovení korekčních faktorů intenzity pro výpočty zpracování dat. Kinetické parametry kcat a Km pro oxidativní deaminaci
vybraných substrátů. Tyto výsledky byly porovnány s paralelními měřeními pomocí zavedené spektrofotometrické metody, která zahrnovala sdruženou reakci křenu peroxidázy a guajakolu a byly diskutovány v kontextu údajů z literatury a databáze BRENDA. Bylo zjištěno, že metoda poskytuje přesné výsledky, které jsou dobře srovnatelné
s paralelní spektrofotometrií. Tato metoda nabízí výhody, jako je nízká spotřeba vzorku, rychlá sériová měření a potenciální použitelnost v testech, kde barevné látky interferují spektrofotometrií.
Abstrakt anglicky: Copper-containing diamine oxidases are ubiquitous enzymes that participate in many important biological processes. These processes include the regulation of cell growth and division, programmed cell death, and responses to environmental stressors. Natural substrates include, for example, putrescine, spermidine, and histamine. Enzymatic activity is typically assayed using spectrophotometric, electrochemical, or fluorometric methods. The aim of this study was to develop a method for measuring activity using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry based on the intensity ratio of product to product-plus-substrate signals in the reaction mixtures. For this purpose, an enzyme purified to homogeneity from pea (Pisum sativum) seedlings was used. The method employed α-cyano-4-hydroxycinnamic acid as a matrix with the addition of cetrimonium bromide. Product signal intensities with pure compounds were evaluated in the presence of equal substrate amounts to determine intensity correction factors for data processing calculations. The kinetic parameters kcat and Km for the oxidative deamination of selected substrates were determined. These results were compared to parallel measurements
using an established spectrophotometric method, which involved a coupled reaction of horseradish peroxidase and guaiacol, and were discussed in the context of data from the literature and the BRENDA database. It was found that the method provides accurate results that are well comparable with parallel spectrophotometry. This method offers advantages such as low sample consumption, rapid serial measurements, and potential applicability in assays where colored substances interfere with spectrophotometry.
Jazyk v originále: angličtina
Název časopisu: Molecules
Rok: 2024
Svazek (ročník): 29
Číslo časopisu v rámci uvedeného svazku: –
Strana od-do: 4878-4892
Impact factor: 4.2
Q1: ne

ISSN časopisu: 1420-3049
Vydavatel: MDPI
Způsob financování: IGA_PrF_2022_025
DOI: 10.3390/molecules29204878